Prise en charge d’un échantillon reçu pour recherche de mycobactéries.
Les prélèvements les plus classiques pour la recherche de mycobactéries sont les expectorations spontanées recueillies le matin et le tubage gastrique qui permet de récupérer les expectorations dégluties la nuit (le prélèvement doit donc se faire au réveil et à jeun). La réalisation d’une aspiration bronchique ou d’un lavage broncho-alvéolaire sont également possibles. Ces prélèvements sont tous susceptibles d’être contaminés par de la flore commensale et une fluidification-décontamination est donc indispensable.
Un frottis du prélèvement est ensuite réalisé sur lame puis coloré au Zielh-Neelson ou à l’auramine (les deux colorations peuvent être couplées pour augmenter la sensibilité). Cet examen direct est systématique.
Quel que soit le résultat de cet examen direct, une mise en culture est nécessaire. Celle-ci passe par l’utilisation de deux types de milieu :
- Milieu solide : les plus fréquemment utilisés sont les milieux de Lowenstein-Jensen (image 1) et Coletsos. Ces milieux sont classiquement incubés pendant 3 mois à 37 degrés. Les tubes sont observés une fois par semaine à la recherche de colonies suspectes. Les mycobactéries ont pour la plupart une croissance lente mais l’observation des tubes dès la première semaine d’incubation est importante pour repérer d’éventuelles contaminations qui envahiraient le tube. Si le cas se présente, une nouvelle décontamination du prélèvement d’origine et un ré-ensemencement sont pratiqués.
Lorsque des colonies suspectes sont repérées par le technicien ou le biologiste, l’identification bactérienne se déroule en plusieurs étapes :
1) Examen direct de la colonie après coloration au Ziehl-Neelson pour vérifier qu’il s’agisse bien d’un BAAR.
2) Recherche d’un antigène spécifique des mycobactéries du complexe tuberculosis : l’antigène MPT-64 : test immuno-chromatographique à partir d’un petit échantillon de la colonie suspecte permettant d’obtenir un résultat en quelques minutes
3) Identification précise de l’espèce bactérienne par PCR, voire par MaldiTof.
- Milieu liquide de type MGIT (image 2) incubé classiquement pendant 42 jours à 37 degrés. La lecture est automatisée (plusieurs lectures par jour) et une alerte est donnée en cas de flacon positif. Lorsqu’une culture est déclarée positive, la démarche d’identification bactérienne est la même que précédemment : examen direct, recherche de l’antigène MPT-64 et PCR.
Enfin, la mise en évidence de colonies de mycobactéries impose la réalisation d’un antibiogramme. La plupart des laboratoires utilise la méthode en milieu liquide. Un inoculum de la souche bactérienne est déposé dans un flacon ne contenant pas d’antibiotique (témoin) puis dans des flacons contenant les antibiotiques à tester (image 3). Après incubation à 37°, l’automate compare la croissance bactérienne dans les flacons contenant les antibiotiques avec celle dans le flacon témoin. L’antibiogramme est obtenu en moyenne après 8 jours.
Pour information, lors de la PCR d’identification, il peut être possible de détecter dès lors une résistance à la rifampicine et à l’isoniazide par analyse des principales mutations responsables. Les gènes les plus souvent impliqués (et donc ciblés) dans la résistance à l’isoniazide sont les gènes katG et ihnA, celui le plus souvent impliqué dans la résistance à la rifampicine est le gène rpoB. Si la PCR permet d’obtenir une indication rapide quant à la résistance éventuelle de la souche bactérienne à ces antibiotiques, cette technique n’est pas suffisante puisque seules les mutations les plus fréquentes sont recherchées.
Pour rappel, on parle de tuberculose MDR (multidrug resistance) lorsque la souche en question est résistante à la rifampicine et l’isoniazide. On parle de tuberculose XDR (extensively drug resistance) si la souche est résistante à la rifampicine, à l’isoniazide, aux fluoroquinolones et à au moins l’un des 3 antituberculeux injectables de 2ème ligne (amikacine, kapréomycine, kanamycine).
Pour terminer, petit réflexe hygiène : n’oubliez pas que la recherche de mycobactérie nécessite un laboratoire de niveau 3, c’est-à-dire avec des normes de sécurité suffisantes !
